苯胺-4-羥化酶（AH）活性檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。
貨號(hào)：BC2740
規(guī)格：50T/24S
產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前取一瓶加入30mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃可保存4周；

2. 試劑三：臨用前取一瓶加入15mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四：臨用前加入10mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃可保存4周；

4. 試劑六：臨用前取一瓶加入15mL蒸餾水，充分溶解；用不完的試劑2-8℃密封保存4周。

5. 標(biāo)準(zhǔn)品：10nmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液

產(chǎn)品說明：
細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。AH在P450酶系中相當(dāng)于CYP2E1亞型，CYP2E1不僅參與了藥物的代謝，而且還能催化多種前致癌物和前毒物的活化過程。
AH催化苯胺羥化后產(chǎn)生的4-氨基酚，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榉?span style="font-family: Times New Roman, Times, serif">-吲哚復(fù)合物，在630nm處有特征吸收峰；通過測定630nm吸光度增加速率，來計(jì)算AH活性。
注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、超速離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、研缽/勻漿器、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、冰和蒸餾水。
操作步驟：

• 粗酶液提取（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約0.5g組織，加入4℃預(yù)冷的1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g，4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。
2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心60min，棄上清液。
3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。
4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加0.5mL試劑二，蓋緊后充分震蕩溶解，即粗酶液，置于冰上待測。
二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至630nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑五置于冰浴冷卻30min。

3. 在EP管加入下列試劑：

三、AH活性計(jì)算
（1）按蛋白濃度計(jì)算
活性單位定義：37℃條件下，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。
AH活性(U/mg prot) = C標(biāo)× V上總×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷（Cpr×V樣）÷T
= 2×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
活性單位定義：37℃條件下，每克組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmol 4-氨基酚為1個(gè)酶活單位。
AH活性(U /g 質(zhì)量) = C標(biāo)×V上總×（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷(V樣×W÷V試劑二)÷T
=（A測定管-A對照管）÷（A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷W
C標(biāo)：10nmol/mL；V上總：反應(yīng)體系中上清總體積，1.5mL；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL），需要另外測定；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.25mL；W：樣本質(zhì)量，g；V試劑二：提取中加入的試劑二體積，0.5mL；T：催化反應(yīng)時(shí)間，30min。



注意事項(xiàng)：
1、如果測定吸光值A＞1.2或ΔA＞0.8，建議稀釋樣本后再測定，計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2、如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進(jìn)行測定，注意同步修改計(jì)算公式。
3、粗酶液提取后需在當(dāng)日完成測定。  

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