谷*酸（Glu）含量檢測試劑盒說明書（WST法）

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC5215

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前取1瓶加入6mL試劑一，用不完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復凍融；

2、 試劑四：臨用前取1支加入0.5 mL試劑二，用不完的試劑-20℃分裝保存2周，避免反復凍融；

3、 標準液：10 μmol/mL谷*酸標準品。

產(chǎn)品說明：

Glu廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，不僅是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸之一，而且通過轉(zhuǎn)氨基作用參與多種氨基酸合成，是生物體內(nèi)主要氨基來源之一。此外，Glu還是味精的主要有效成分，常用做食品添加劑以及香料生產(chǎn)。

谷*酸脫氫酶（GDH）催化谷*酸和NAD生成α-酮戊二酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應，產(chǎn)生水溶性formazan，計算谷*含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/超聲破碎儀、冰、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

細菌、細胞：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每500萬細菌或細胞加入1mL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率200w，超聲3s，間隔10s，重復30次），10000g，常溫離心10min，取上清待測。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一，進行冰浴勻漿，10000g，常溫離心10min，取上清待測。

液體：直接測定。（若有渾濁則離心后取上清測定）

二、測定步驟

1. 分光光度計/酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2. 標準溶液的制備：將標準品用蒸餾水分別稀釋為0.625，0.3125，0.15625，0.07813，0.039、0.0195、0.01、0.005、0.0025μmol/mL的標準溶液。

3. 標準品稀釋表：

實驗中每個標準管需40µL標準溶液。

4. 操作表：

三、谷*酸含量計算

1. 標準曲線的繪制：

根據(jù)標準管的濃度（x，µmol/mL）和吸光度ΔA標準（y，ΔA標準），建立標準曲線。根據(jù)標準曲線，將ΔA代入方程得到x（µmol/mL）。

2. 谷*酸含量計算：

（1）按照蛋白濃度計算：

谷*酸含量（µmol/mg prot）=x×V樣本÷（Cpr×V樣本）=x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算：

谷*酸含量（µmol/g 質(zhì)量）=x×V樣本÷（W÷V樣總×V樣本）=x÷W

（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算：

谷*酸含量（μmol/10⁴ cell）=x×V樣本÷（500÷V樣總×V樣本）=0.002x

（4）按照液體體積計算：

谷*含量（μmol/mL）=x×V樣本÷V樣本=x

V樣總：加入提取液體積，1mL；V樣本：加入的樣本體積，0.04mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

實驗實例：

1、稱取約 0.1g 鼠肺，加入 1mL試劑一，冰浴研磨，10000g，常溫離心10min取上清，待測。之后按照測定步驟操作，用 96 孔板測得計算 ΔA =A2 -A1=0.449-0.384=0.065，標準曲線y=1.5338x+0.0091，根據(jù)標曲得出x=0.036，谷*酸含量得：
*氨酸含量（µmol/g 質(zhì)量）=x×V樣本÷（W÷V樣總×V樣本）=x÷W=0.36µmol/g。

2、吸取0.04 mL羊血清，按照測定步驟操作，用 96 孔板測得計算ΔA =A2-A1=0.379-0.105=0.274，標準曲線y=1.5338x+0.0091，根據(jù)標曲得出x=0.173，谷*酸含量得：
谷*酸含量（μmol/mL）=x×V樣本÷V樣本=x=0.173μmol/mL。

相關發(fā)表文獻：

[1] Yanan Wang,Chengzhen Liang,Zhigang Meng,et al. Leveraging Atriplex hortensis choline monooxygenase to improve chilling tolerance in cotton. Environmental and Experimental Botany. June 2019;162:364-373.(IF3.712)

參考文獻：

[1] Beck R, Malthe-S?renssen D, Andreassen J P. Polycrystalline growth in precipitation of an aromatic amine derivative and l-glutamic acid[J]. Journal of crystal growth, 2009, 311(2): 320-326.

相關系列產(chǎn)品：

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