輔酶 II NADP(H)含量檢測試劑盒說明書（WST顯色法）

微量法

貨號：BC5205

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入4mL蒸餾水充分混勻，溶解后2-8℃保存4周。

2、 試劑四：臨用前將試劑四A溶解到試劑四B中，分裝保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存4周。

3、 NADP標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.27 mL 蒸餾水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

4、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入 1.2 mL 蒸餾水，即 5 µmol/mL，-20℃可以保存2周。

產(chǎn)品說明：

輔酶Ⅱ NADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP⁺和 NADPH 含量測定可以計算 NADP（NADPH + NADP⁺)含量和 NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP⁺比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP⁺和NADPH。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADPH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰，而NADP⁺可被6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原為NADPH，進(jìn)一步采用WST-1檢測。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機、水浴鍋、研缽/勻漿器、超聲破碎儀，可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、血清（漿）中NADP⁺和NADPH的提取：

NADP⁺的提取：取血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1:5-10的比例，（建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL酸性提取液），煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測。

NADPH的提取：取血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1:5-10的比例，（建議取0.1mL血清（血漿），加入0.5 mL堿性提取液），煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測。

2、組織中NADP⁺和NADPH的提?。?/span>

NADP⁺的提取：建議取0.1g組織質(zhì)量，加入0.5mL酸性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測。

NADPH的提取：建議取0.1 g組織質(zhì)量，加入0.5 mL堿性提取液，冰浴研磨，煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測。

3、細(xì)胞或細(xì)菌中NADP⁺和NADPH的提?。?/span>

NADP⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，離心棄上清，建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL酸性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復(fù)30次），煮沸5min(蓋緊，以防止水分散失)，冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL堿性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測。

NADPH的提取：建議500萬細(xì)胞或者細(xì)菌加入0.5mL堿性提取液，超聲波破碎（冰浴，功率200W，超聲3s，停10s，重復(fù)30次），煮沸 5min(蓋緊，以防止水分散失)；冰浴冷卻后，10000g， 4℃離心10min；取200μL上清液，加入200μL酸性提取液使之中和；混勻，10000g 4℃離心 10min，取上清,冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 NADP⁺標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0nmol/mL即空白管）。

3、 NADPH標(biāo)準(zhǔn)品：用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0nmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0nmol/mL即空白管）。

4、 稀釋表（附于說明書最后）

5、 在EP管中按順序加入下列試劑：

   混勻，取200μL至微量玻璃皿或96孔板中，讀取吸光值，NADP⁺的記為：ΔA _NADP+= A₂- A₁，NADPH的記為ΔA_NADPH= A₂’- A₁’，NADP標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NADP標(biāo)}= A_標(biāo)-A_空白管。NADPH標(biāo)準(zhǔn)管的記為ΔA _{NADPH標(biāo)}= A_標(biāo)’-A_空白管。（標(biāo)準(zhǔn)曲線只需做1-2次，每個測定管需設(shè)一個對照管）。

三、NADP⁺和NADPH含量計算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

（1） NADP⁺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₁，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₁，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定代入方程得到x₁（nmol/mL）。

（2） NADPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x₂，nmol/mL）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y₂，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA′代入方程得到x₂（nmol/mL）。

2、NADP⁺和NADPH含量計算

（一）NADP⁺含量計算

（1） 按液體體積計算：NADP⁺含量(nmol/mL）= x₁×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₁

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NADP⁺ (nmol/mg prot）= x₁×V提取÷(V提取×Cpr)= x₁ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NADP⁺含量(nmol/g質(zhì)量）= x₁×V提取÷W= x₁÷W 

（4） 按細(xì)胞數(shù)量計算：NADP⁺含量(nmol/10⁴ cell）= x₁×V提取÷500=0.002×x₁

（二）NADPH含量計算

（1） 按液體體積計算：NADPH含量(nmol/mL）= x₂×（V提取+V血清）÷V血清=11×x₂

（2） 按樣本蛋白濃度計算 NADPH (nmol/mg prot）= x₂×V提取÷(V提取×Cpr)= x₂ ÷ Cpr

（3） 按樣本鮮重計算NADPH含量(nmol/g 質(zhì)量）= x₂×V提取÷W= x₂÷W 

（4） 按細(xì)胞數(shù)量計算：NADPH含量(nmol/10⁴ cell）= x₂×V提取÷500=0.002×x₂

V提取：加入提取液體積，1mL；V血清：血清（漿）體積，0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣

本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。

注意事項：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三按比例配成混合液。

2、反應(yīng)過程中注意避光。

3、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒100管可以測定48個NADP⁺或NADPH。

4、如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進(jìn)行測定。同步修改計算公式。

實驗實例：

1. 1、NADP⁺的測定：稱取 0.1g冬青葉片，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.075-0.069=0.006，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.098，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=0.98 nmol/g 質(zhì)量。

NADPH的測定：稱取 0.1g 冬青葉片，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.155-0.110=0.045，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=1.335，NADPH含量得：  NADPH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=13.35 nmol/g 質(zhì)量。

2. NADP⁺的測定：稱取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.194-0.146=0.048，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.3，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/g 質(zhì)量）= x₁÷W=2.999nmol/g 質(zhì)量。

NADPH的測定：稱取 0.1g 小鼠肝臟，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.170-0.141=0.029，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=1，NADPH含量得：

NADPH (nmol/g 質(zhì)量）= x₂÷W=10 nmol/g 質(zhì)量。

3. NADP⁺的測定：取0.1mL牛血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.077-0.067=0.010，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₁=0.2081x-0.0144,根據(jù)標(biāo)曲得出x₁=0.117，NADP⁺含量得：

NADP⁺ (nmol/mL）= 11×x₁=1.29 nmol/mL。

NADPH的測定：取0.1mL牛血清，按提取步驟提取后按照測定步驟操作，96孔板測得吸光值后計算 ΔA 測定=A測定-A對照=0.084-0.072=0.012，標(biāo)準(zhǔn)曲線y₂=0.0478x-0.0188,根據(jù)標(biāo)曲得出x₂=0.644，NADPH含量得：

NADPH (nmol/mL）= 11×x₂=7.088 nmol/mL。

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