β-羥丁酸（β-HB）含量檢測試劑盒（WST法）說明書

微量法

貨號：BC5085

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前取一支加入600μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃可保存3周。避免反復(fù)凍融。

2、 試劑三：臨用前取一支加入400μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存，可以保存2周。避免反復(fù)凍融。（試劑三由于不便保存，故多給一支）

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：8mg 3-羥基丁酸鈉。臨用前加入980μL蒸餾水，充分溶解，即8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液。4℃保存1個月。

4、 工作液配制：臨用前根據(jù)試驗所需量將試劑一、試劑二、試劑三按照170:8:2（共180μL，1T的量）的比例配成工作液，充分混勻，置于37℃保溫15min（此步驟不可省略），現(xiàn)用現(xiàn)配，工作液在4h內(nèi)用完。

產(chǎn)品說明：

β-羥丁酸（β-HB），在嚴重酸中毒患者體內(nèi)，由于酸中毒使患者體內(nèi)NADH生成增加，進而促使β-羥丁酸與乙酰乙酸的比值自正常的2:1提高至16:1。β-羥丁酸在檢測糖尿病酮癥酸中毒診斷、治療中有重要意義，對糖尿病的早期診斷也有重要意義。本試劑盒適用于血清、血漿、尿液等樣本

在pH8.8和37℃條件下，β-HB在β-羥丁酸脫氫酶（HBDH）催化下發(fā)生反應(yīng)，同時NAD⁺被還原成NADH；在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，在450nm下有特征吸收峰。通過檢測450nm下波長變化，可計算出β-HB的含量。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸餾水。

操作步驟：

適用樣本

血清、血漿、尿液等樣本，直接檢測即可，若溶液有渾濁可離心后進行測定

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至450 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：將8mg/mL 3-羥基丁酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水稀釋至0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

3、 按下表步驟加樣：

三、β-HB含量計算

1、 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以β-HB標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x，mg/mL），以ΔA標(biāo)準(zhǔn)為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程y=kx+b，將ΔA測定帶入方程求得x（mg/mL）。

2、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

β-HB含量（μmol /mg prot）=x×V樣÷（V樣×Cpr）÷126.09×1000=7.931x÷Cpr

（2）按照血清（漿）體積計算

β-HB含量（μmol /mL）=x×V樣÷V樣÷126.09×1000=7.931x

V樣：反應(yīng)中加入樣本體積，20 μL=0.02 mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；126.09：β-羥基丁酸鈉的分子量，mg/mmol；1000：1mmol=1000μmol。

注意事項：

1、顯色完成后，請在10 min之內(nèi)完成檢測。

2、如果ΔA測定低于或超過標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光值范圍，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

實驗實例：

1. 取20μL 牛血清按上述步驟進行實驗，用96孔板測定后進行計算ΔA測定=A測定-A對照=0.455-0.082=0.373，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.4913x+0.0043，得x=0.750。計算

β-HB含量（μmol /mL）=7.931x=5.948 μmol /mL

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