肌酸含量檢測試劑盒（酶法）說明書

微量法

貨號：BC4935

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

試劑一：臨用前每支加入550 μL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存。

試劑二：臨用前每支加入0.15 mL蒸餾水，充分溶解。用不完的試劑分裝后-20℃保存。

試劑三：臨用前每支加入0.5 mL蒸餾水（100T/48S），充分溶解。為方便儲存故多給一支。用不完的試劑分裝后-20℃保存。

試劑四：臨用前根據(jù)試驗所需用量，按照試劑四A液：試劑四B液=1:1，充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)品：1 mg一水肌酸。臨用前加入1 mL蒸餾水，充分溶解，即1 mg/mL一水肌酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。臨用前取20μL和80μL蒸餾水混合配制成200μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)溶液待測?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

肌酸(Creatine)是一種含氮化合物，自然存在于脊椎動物體內(nèi)，能夠輔助為肌肉和神經(jīng)細(xì)胞提供能量。肌酸可由精*酸（arginine)、甘*酸（glycine）及甲*氨酸（methionine）三種氨基酸合成，可由人體自行合成，也可以從食物中攝取。大約95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式為磷酸肌酸。肌酸作為一種補(bǔ)充劑主要通過增加肌肉質(zhì)量，增強(qiáng)運(yùn)動表現(xiàn)能力。肌酸也被作為神經(jīng)肌肉疾病的一種治療藥被廣泛研究，它可能有助于保護(hù)神經(jīng)和改善細(xì)胞生物功能狀態(tài)。

肌酸酶偶聯(lián)肌氨酸氧化酶，可將肌酸轉(zhuǎn)化為甘*酸、甲醛、過氧化氫，過氧化物酶催化過氧化氫氧化4-氨基安*比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在505nm 有特征吸收峰。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、超聲破碎儀。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、細(xì)菌、細(xì)胞樣本的制備：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）: 提取液一體積（mL）為500~1000: 1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1 mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300W，超聲3秒，間隔9秒，總時間5 min）；于4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

2、組織樣本的制備：按照質(zhì)量（g）: 提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

3、血清（漿）：取100 μL血清（漿）加入1 mL提取液一，4℃ 12000 g離心10 min，取0.8 mL上清液，再加入0.15 mL提取液二，4℃，12000 g離心10 min后取上清待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 按下表步驟加樣：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酸含量計算

1、 計算公式

（1）按照蛋白濃度計算

肌酸含量（μg/mg prot）=C標(biāo)×V樣×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷（V樣×Cpr）×0.879=175.8×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷Cpr×0.879

（2）按照樣本質(zhì)量計算

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）= C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×0.879

= 208.76×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷W

（3）按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計算

肌酸含量（μg/10⁴ cells）=C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×（V上清+V提取液二）÷（細(xì)胞數(shù)量×V上清÷V提取液一）×0.879

=208.76×ΔA測÷ΔA標(biāo)÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照血清（漿）體積計算

肌酸含量(μg/mL) =C標(biāo)×ΔA測÷ΔA標(biāo)×(V上清+V提取液二)÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)]×0.879 =2296.39×ΔA測÷ΔA標(biāo)

C標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，200 μg/mL；V樣：加入樣本體積，20 μL=0.02mL；V上清：提取時上清液體積，0.8 mL；V提取液一：加入提取液一體積，1 mL；V提取液二：加入提取液二體積，0.15 mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；細(xì)胞數(shù)量：以萬計；V液體：液體樣本體積，0.1 mL；0.879：換算系數(shù)，一水肌酸相對分子質(zhì)量149.15，無水肌酸相對分子質(zhì)量131.13，0.879=131.13÷149.15。

注意事項：

1、 顯色完成后，請在10 min之內(nèi)完成檢測。

2、 提取液中含有蛋白沉淀劑，提取的上清液不能用于蛋白濃度的測定。若想要用蛋白濃度計算肌酐含量需要另取組織或血清（漿），即取相同質(zhì)量（體積）的組織（血清（漿））用1.1875mLPBS（生理鹽水）勻漿（相當(dāng)于提取步驟最終樣本上清液），用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。

3、 如果測定吸光值超過標(biāo)準(zhǔn)管吸光值，建議用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測定。如果測定吸光值過小，建議增大樣本量后再進(jìn)行測定。

實驗實例

取0.1g兔腎臟加入1mL提取液一進(jìn)行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，用96孔板測得數(shù)據(jù)后計算ΔA測定=A測定-A對照=0.108-0.074=0.034，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.806-0.053=0.753。按樣本質(zhì)量計算含量得：

肌酸含量（μg/g 質(zhì)量）=208.76×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W =94.26μg/g 質(zhì)量。

取100μL牛血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，用96孔板測得數(shù)據(jù)后計算ΔA測定=A測定-A對照=0.122-0.062=0.06，ΔA標(biāo)準(zhǔn)= A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.806-0.053=0.753。按照液體體積計算含量得：

肌酸含量（μg/mL）=2296.39×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)=282.98μg/mL血清。

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