丙酮酸（PA）含量檢測試劑盒（酶法）說明書

                                               微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5265

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前加入1.2mL蒸餾水充分溶解，分裝保存，-20℃可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑三：臨用前按試劑三：蒸餾水=1μL：100μL（約6T）的比例進(jìn)行稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：20 μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：

丙酮酸通過乙酰 CoA 連接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代謝，起著重要的樞紐作用。

在pH = 7.5 時，丙酮酸在LDH的催化作用下與NADH反應(yīng)，生成NAD ⁺ 和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan。通過檢測450nm條件下吸光值，可以計算出丙酮酸含量。

注意：實(shí)驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、可調(diào)式移液槍、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁶個）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200w，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3. 血清（漿）等其他液體：直接檢測。若有沉淀請離心后取上清待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到450nm，分光光度計蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一37℃預(yù)熱20min。

3、 標(biāo)準(zhǔn)品的制備：將20μmol/mL丙酮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋得到1、0.625、0.5、0.3125、0.25、0.15625μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

4、 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

實(shí)驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需20µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

5、 操作表：（在1.5mL EP管中依次加入下列試劑）

三、丙酮酸含量計算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}（y，ΔA_{標(biāo)準(zhǔn)}），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA_測定代入方程得到x（μmol/mL）。

2、丙酮酸含量計算：

（1）按液體樣本的體積計算

丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣= x

（2）按組織質(zhì)量計算

丙酮酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= x×V樣÷(V樣÷V提×W) = x÷W

（3）按蛋白濃度計算

丙酮酸含量（μmol/mg prot）= x×V樣÷（Cpr×V樣）= x÷Cpr

（4）按細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量計算

丙酮酸含量（μmol/10⁶ cell）= x ×V樣÷（V樣÷V提×N）= x÷N

V樣：加入的樣本體積，0.02mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；V提：加入提取液的體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量，以百萬計。

注意事項：

1. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者用蒸餾水稀釋樣本后再進(jìn)行測定。

實(shí)驗實(shí)例：

1、 稱取約0.1g鼠肺，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g，4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=（A_空白1- A_空白2）-（A_測定-A_對照）=（1.156-0.045）-（0.595-0.271）=0.787，標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217，x=0.900µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 質(zhì)量）= x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =9.00µmol/g 質(zhì)量。

2、 稱取約0.1g鳶尾，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g， 4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定=（A_空白1- A_空白2）-（A_測定-A_對照）=（1.156-0.045）-（0.545-0.207）=0.773，標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217，x=0.884µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 質(zhì)量） = x×V樣 ÷(V樣÷V提×W) = x÷W =8.837µmol/g 質(zhì)量。

3、 收集約500萬細(xì)胞，加入1mL提取液，超聲波破碎（功率 200w，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），8000g，4℃離心10min，取上清待測。之后按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定= （A_空白1- A_空白2）-（A_測定-A_對照）=（1.156-0.045）-（0.770-0.098）=0.439，標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217，x=0.491µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（μmol/10⁶ cell）= x ×V樣÷（V樣÷V提×5）=0.2 x= 0.098 μmol/10⁶ cell。

4、 吸取0.02mL的馬血清，按照測定步驟操作，用96孔板測得計算ΔA_測定= （A_空白1- A_空白2）-（A_測定-A_對照）=（1.156-0.045）-（1.139-0.113）=0.085，標(biāo)曲y=0.8502x+0.0217，x=0.074µmol/mL, 計算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V樣÷V樣= x =0.074μmol/mL。

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