AX蘋果酸含量檢測(cè)試劑盒（WST顯色法）說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC5490

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入13 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

2. 試劑四：臨用前加入80μL試劑四稀釋液溶解（可震蕩促進(jìn)溶解），可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

3. 試劑四工作液：臨用前按試劑四：試劑四稀釋液=10μL：1mL（約8T）的比例稀釋試劑四備用，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4. 標(biāo)準(zhǔn)品：100μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液;

5. 0.4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液：臨用前取20μL 100μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入480μL蒸餾水，充分混勻，配制成4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液；再取100μL 4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)配現(xiàn)用，作為標(biāo)準(zhǔn)管標(biāo)準(zhǔn)溶液使用。（實(shí)驗(yàn)中每管需要100μL標(biāo)準(zhǔn)品，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積）。

產(chǎn)品說明：

L-蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，也是蘋果酸-天冬氨酸穿梭的重要組成部分。蘋果酸-天冬氨酸穿梭是氧化磷酸化的還原當(dāng)量跨線粒體膜運(yùn)輸過程所必需的。在低等生物體內(nèi)，蘋果酸在蘋果乳酸發(fā)酵的過程中轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)產(chǎn)生CO₂。蘋果酸常用作食品和制藥工業(yè)的添加劑，蘋果酸的定量分析在啤酒、葡萄酒、奶酪和水果生產(chǎn)領(lǐng)域也具有至關(guān)重要的作用。

蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性Formazan，在450nm下有最大吸收峰，據(jù)此可計(jì)算蘋果酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī)、1mL玻璃比色皿、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液一體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測(cè)。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測(cè)定步驟

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，波長(zhǎng)調(diào)至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>EP管中）

三、 蘋果酸含量的計(jì)算

1. 按照蛋白含量計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/mg prot）=ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

=0.4×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/g 質(zhì)量）=ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）×F =0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/10⁶ cell）=ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）×F =0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

4. 按照液體體積計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/mL）
= ΔA測(cè)定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷(V提取液一+V液體)] ×F
= 5.225×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.4μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.1mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測(cè)定；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細(xì)胞數(shù)量，10⁶個(gè)；V液體：液體樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測(cè)定。如需測(cè)定蛋白含量，需另取組織。

2. ΔA測(cè)定的測(cè)定范圍在0.01-1.5之間。如果測(cè)定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測(cè)定，如果測(cè)定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測(cè)定，注意同步計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1g蘋果果肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清用蒸餾水稀釋4倍后按照測(cè)定步驟操作，使用1mL比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=1.1520-0.1022= 1.0498，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.7413-0.1022=0.6391，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

蘋果酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= 0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F=31.21 μmol/g質(zhì)量。

2. 取0.1g兔肝臟加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測(cè)定步驟操作，使用1mL比色皿測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A測(cè)定-A對(duì)照=0.2746-0.1022=0.1724，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.7413-0.1022=0.6391，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

蘋果酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= 0.475×ΔA測(cè)定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =1.28 μmol/g質(zhì)量。

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