游離血紅蛋白（FHb）含量檢測試劑盒說明書

可見分光光度法

貨號：BC5590

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 工作液：臨用前根據(jù)樣本量按照試劑一：試劑二：試劑三=500μL：500μL：25μL（1.025mL，約1T）的比例配制工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2. 標(biāo)準(zhǔn)品：5mg血紅蛋白，臨用前加入1mL蒸餾水，充分混勻，配制成5mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，2-8℃可保存4周。

產(chǎn)品說明：

血管內(nèi)發(fā)生溶血時，紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白，血漿中游離血紅蛋白（free hemoglobin，FHb）增多。自身免疫性溶血性貧血、鐮刀型細胞貧血、珠蛋白生成障礙性貧血患者血漿FHb有輕度至中度增加，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥、陣發(fā)性嚴寒性血紅蛋白尿癥、不穩(wěn)定血紅蛋白病等會出現(xiàn)血尿癥狀。因此，血漿中FHb的測定對于臨床診斷溶血性疾病有重要作用。

血紅蛋白中的亞鐵血紅素有類似過氧化物酶的催化活性，能夠催化過氧化氫氧化4-氨基安*比林和苯胺類似物，生成紫色化合物，其在546nm有特征吸收峰，其顏色深淺與FHb含量成正比。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、1mL玻璃比色皿、可調(diào)式移液槍、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理

血漿等液體：直接測定。若有渾濁請離心后取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 可見分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至546nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：將5mg/mL（5000mg/L）血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水進行稀釋得到156.25、78.125、39.063、19.531、9.766、4.883mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋可參考下表：

備注：實驗中每個標(biāo)準(zhǔn)管需60µL標(biāo)準(zhǔn)溶液。

4、 將工作液37℃預(yù)熱15min。

5、 在1mL玻璃比色皿中按下表步驟加樣：

三、游離血紅蛋白（FHb）含量計算

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（x，mg/L）和吸光度ΔA標(biāo)準(zhǔn)（y，ΔA標(biāo)準(zhǔn)），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將ΔA測定（y，ΔA測定）帶入公式計算樣本濃度（x，mg/L）。

2. FHb含量的計算：

游離血紅蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F

F：樣本稀釋倍數(shù)。

注意事項：

1. 若測定血漿樣本，采樣和分離血漿過程中避免發(fā)生溶血。

2. 若樣本測定管吸光值A(chǔ)測定＞1，建議將樣本用蒸餾水稀釋后再進行測定。

3. 若樣本測定管吸光值A(chǔ)測定＜0.01或接近空白管吸光值，建議將樣本加樣量增大后再進行測定，空白管和標(biāo)準(zhǔn)管加樣量也需進行相應(yīng)調(diào)整。

實驗實例：

1. 取60µL兔血清樣本，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白= 0.216-0.064= 0.152，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007x-0.0075，R²=0.9981。計算x=22.786，計算FHb含量得：

游離血紅蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F=22.786 mg/L。

2. 取60µL馬血清樣本，按照測定步驟操作，用1mL玻璃比色皿測得計算：ΔA測定=A測定-A空白= 0.166-0.064= 0.102，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.007x-0.0075，R²=0.9981。計算x=15.643，計算FHb含量得：

游離血紅蛋白（FHb）含量（mg/L）=x×F=15.643 mg/L。

參考文獻：

[1] Reeder B, Svistun enko D, Cooper C, et al. The radical and redox chemistry of myoglobin and hemoglobin: from in vitro studies to human pathology [J]. Antioxid Redox Signal, 2004, 6(6): 954-966.

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