類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

紫外分光光度法

貨號(hào)：BC5660

規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液：臨用前將粉劑一倒入提取液中，此溶液為懸濁液，使用前搖勻即可；

2、 試劑二工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑二= 855μL:45μL（900μL，2T）的比例配制，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

3、 試劑三：臨用前加入30 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑六：臨用前加入10 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

5、 試劑七：試劑放于試劑瓶?jī)?nèi)玻璃瓶中。臨用前加入9 mL蒸餾水溶解，未用完的試劑分裝保存，-20℃保存可以保存4周，避免反復(fù)凍融；

6、 工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：試劑四：試劑五：試劑六：試劑七=1.4mL：5μL：2μL：0.3 mL：0.3 mL（2007μL，約2T）的比例配制，充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。（試劑四、試劑五使用前需先將液體離心至底部使用）

產(chǎn)品說(shuō)明：

類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycose flavonoid glycosyltransferase, UFGT）是莽草酸途徑的最后一個(gè)作用酶，也是使花色素形成穩(wěn)定的花色苷的第一個(gè)作用酶，并使其由無(wú)色轉(zhuǎn)為有色；UFGT是果實(shí)著色過(guò)程中的關(guān)鍵酶，它使不穩(wěn)定的花色素轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花色苷。

UFGT催化UDPG與槲皮素生成UDP和槲皮素糖苷；UDP在丙 酮酸激酶與乳酸脫氫酶作用下，氧化NADH為NAD⁺，NAD⁺生成速度與UDP含量成正比，通過(guò)340nm吸光度下降速度反映UFGT活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟

1、 紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 加樣表：首先在1.5mLEP管中按下表步驟加樣：

三、類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶（UFGT）活力計(jì)算

1、按照蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每小時(shí)催化1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

UFGT活力(U/mg prot ) = ΔA×V反總II÷（ε×d）×10⁹÷ （Cpr ×V樣÷V反總I×V上清）÷T×F
=4019.29×ΔA ÷Cpr×F

2、按樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織每小時(shí)催化1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

UFGT活力(U/g 質(zhì)量) = ΔA×V反總II÷（ε×d）×10⁹÷（W× V樣÷V樣總÷V反總I×V上清）÷T×F
 =4019.29×ΔA÷W×F

V反總I：30℃第一步反應(yīng)體系總體積（V樣+ V試劑二工作液+V試劑三），1 mL；V反總II：37℃第二步反應(yīng)體系總體積，1×10^-3 L；ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：石英比色皿光徑，1cm；V樣：加

入樣本體積，0.1mL；V上清：第二步反應(yīng)中上清液體積，0.1 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，4h；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；F：稀釋倍數(shù)；10⁹：換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

注意事項(xiàng)：

1、 如果A1測(cè)定＜A1空白或者ΔA大于0.5，可以對(duì)上清液進(jìn)行稀釋或者縮短30℃反應(yīng)時(shí)間重新測(cè)定；?A小于0.005，可以加大樣本量或者延長(zhǎng)30℃反應(yīng)反應(yīng)時(shí)間重新測(cè)定。最終計(jì)算時(shí)同步修改計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 稱取0.1078g洋桔梗，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得計(jì)算A測(cè)定=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.07-1.038=0.032，A空白=A1空白-A2空白=0.823-0.807=0.016，?A =A測(cè)定-A空白=0.016。帶入公式計(jì)算：

UFGT活力(U/g 質(zhì)量)= 4019.29×ΔA÷W=596.56 U/g 質(zhì)量

2、 稱取0.1133g洋蔥，加入提取液進(jìn)行冰浴勻漿，按照測(cè)定步驟操作，用1mL石英比色皿測(cè)得計(jì)算A測(cè)定=A1測(cè)定-A2測(cè)定=0.838-0.809=0.029，A空白=A1空白-A2空白=0.823-0.807=0.016，?A =A測(cè)定-A空白=0.013。帶入公式計(jì)算：

UFGT活力(U/g 質(zhì)量)= 4019.29×ΔA÷W=461.17 U/g 質(zhì)量

參考文獻(xiàn)：

[1] Parvaneh, TaherehAbedi, BahramDavarynejad, Gholam HosseinMoghadam, Ebrahim Ganji. Enzyme activity, phenolic and flavonoid compounds in leaves of Iranian red flesh apple culti vars grown on different rootstocks[J]. Scientia horticulturae, 2019, 246.

[2] Mori K, Sugaya S, Gemma H. Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition[J]. Hort, 2005, 105(3):319-330. 

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