蘋(píng)果酸合酶（MS）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法

貨號(hào)：BC5765

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問(wèn)請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑三：臨用前加入600μL蒸餾水充分溶解，未用完的試劑-20℃分裝保存4周，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說(shuō)明：

蘋(píng)果酸合酶（Malate Synthase，EC2.3.3.9）是屬于轉(zhuǎn)移酶中?；D(zhuǎn)移酶的一類，主要存在于植物和微生物中。是乙醛酸循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，在MS催化下乙醛酸與乙酰輔*A反應(yīng)生成蘋(píng)果酸。

MS催化乙酰CoA和乙醛酸產(chǎn)生蘋(píng)果酸，同時(shí)生成輔*A，輔*A使無(wú)色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在412nm處有特征吸收峰，據(jù)此可以計(jì)算MS活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、低溫離心機(jī)、水浴鍋、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2. 細(xì)菌/細(xì)胞：按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬(wàn)細(xì)菌/細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎（功率200W，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間5min）；然后12000 g，4℃離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3. 培養(yǎng)上清等液體：直接檢測(cè)，若有渾濁可以離心后取上清測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至412nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 試劑一25℃預(yù)熱15min。

3、 樣本測(cè)定（在1.5mL EP管中加入下列試劑）

（1）酶促反應(yīng)

（2）顯色反應(yīng)

三、蘋(píng)果酸合酶（MS）計(jì)算公式

1. 使用微量比色皿測(cè)定：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：25℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（Cpr×V樣）÷T×F =21×ΔA÷Cpr×F

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（W÷V提取×V樣）÷T×F =21×ΔA÷W×F

（3） 按細(xì)菌/細(xì)胞計(jì)算：

酶活定義：25℃下每10⁶個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（N÷V提取×V樣）÷T×F =21×ΔA÷N×F

（4） 按液體體積計(jì)算：

酶活定義：25℃下每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷V樣÷T×F =21×ΔA÷N×F

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：比色皿光徑，1cm；V顯色：顯色反應(yīng)總體積，0.2mL；V上清液：顯色反應(yīng)中上清液體積，0.14mL；V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體

積，0.05mL；V提取：加入提取液的體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計(jì)。

2. 使用96孔板測(cè)定：

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：25℃下每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（Cpr×V樣）÷T×F =35×ΔA÷Cpr×F

（2） 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：25℃下每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（W÷V提取×V樣）÷T×F =35×ΔA÷W×F

（3） 按細(xì)菌/細(xì)胞計(jì)算：

酶活定義：25℃下每10⁶個(gè)細(xì)菌/細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/10⁶ cell）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷（N÷V提取×V樣）÷T×F =35×ΔA÷N×F

（4） 按液體體積計(jì)算：

酶活定義：25℃下每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol TNB定義為一個(gè)酶活力單位。

MS活性（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V顯色÷V上清液×V酶促÷V樣÷T×F =35×ΔA÷N×F

ε：TNB摩爾消光系數(shù)，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；d：96孔板光徑，0.6cm；V顯色：顯色反應(yīng)總體積，0.2mL；V上清液：加樣表上清液體積，0.14mL；V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)體系中加入的樣本體積，0.05mL；V提?。杭尤胩崛∫旱捏w積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，20min；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，以10⁶計(jì)。

注意事項(xiàng)：

1. 測(cè)定過(guò)程中樣本和所有試劑在冰上放置，以免變性和失活。

2. 最好兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3. 若樣本ΔA<0.01，可適當(dāng)增大樣本量重新提取或增大加樣表樣本體積（可同時(shí)降低試劑一體積保證總體積不變）后測(cè)定；若樣本ΔA>1.0或A測(cè)定>1.5，可用蒸餾水稀釋上清液后測(cè)定，注意同步修改計(jì)算公式中的稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1141g霉菌加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照=0.247-0.206=0.041，按樣本質(zhì)量計(jì)算MS活性得：

MS活性（U/g 質(zhì)量）=35×ΔA÷W×F =12.577 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1169g萌芽的綠豆加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后用蒸餾水稀釋2倍后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照=0.406-0.244=0.162，按樣本質(zhì)量計(jì)算MS活性得：

MS活性（U/g 質(zhì)量）=35×ΔA÷W×F =97.006 U/g 質(zhì)量。

3、 取0.1102g芒果加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿，取上清后按照測(cè)定步驟操作，用96孔板測(cè)得ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照=0.341-0.153=0.188，按樣本質(zhì)量計(jì)算MS活性得：

MS活性（U/g 質(zhì)量）=35×ΔA÷W×F =97.710 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Roucourt B, Minnebo N, Augustijns P, Hertveldt K, Volckaert G, Lavigne R. Biochemical characterization of malate synthase G of P. aeruginosa. BMC Biochem. 2009 Jun 24;10:20.

[2] Miernyk JA, Trelease RN, Choinski JS. Malate synthase activity in cotton and other ungerminated oilseeds: a survey. Plant Physiol. 1979 Jun;63(6):1068-71.

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