磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）活性檢測(cè)試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請(qǐng)注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC2195

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品組成：使用前請(qǐng)認(rèn)真核對(duì)試劑體積與瓶?jī)?nèi)體積是否一致，有疑問請(qǐng)及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑四：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

2、 試劑五：臨用前加入2 mL蒸餾水充分溶解待用；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 試劑六：臨用前加入250μL 試劑六溶解液溶解；可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

4、 試劑七：臨用前加入5.26 mL蒸餾水，可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

5、 工作液的配制：根據(jù)樣本數(shù)量按體積比試劑二：試劑三：試劑四：試劑五：試劑六：試劑六溶解液：試劑七=270μL：270μL：270μL：270μL：35μL：325μL：360μL（共1.8mL，20T）的比例混合。工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

產(chǎn)品說明：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（EC 4.1.1.31）廣泛存在于植物和微生物中，在動(dòng)物及絲狀霉菌中缺乏此酶。是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應(yīng)生成草酰乙酸呈不可逆反應(yīng)的酶，同時(shí)也是C4植物和CAM植物固定CO₂的關(guān)鍵酶，對(duì)三羧酸循環(huán)的運(yùn)轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO₄^2-，蘋果酸脫氫酶進(jìn)一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測(cè)定NADH減少速率，計(jì)算PEPC活性。

Phosphoenolpyruvate + CO₂                                   Oxalylacetic Acid + HPO₄^2-

Oxalylacetic Acid + NADH                        Malic acid + NAD⁺

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者

增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96孔UV板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃，離心20min。

2、細(xì)菌或細(xì)胞：按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后8000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待測(cè)。

3、血清（漿）等液體：直接檢測(cè)。若有渾濁則離心后取上清測(cè)定。

二、測(cè)定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm，分光光度計(jì)蒸餾水調(diào)零。

2、 根據(jù)樣本量取部分試劑一和工作液置于30℃平衡10min。

3、 操作表（在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑）：

在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入上述試劑，充分混勻后于340nm處測(cè)定10s時(shí)的吸光值A1，迅速置于30℃水浴或培養(yǎng)箱5min（酶標(biāo)儀有控溫功能的可將溫度調(diào)至30℃），拿出迅速擦干測(cè)定310s時(shí)的吸光值A2，計(jì)算ΔA測(cè)定管=A1測(cè)定-A2測(cè)定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測(cè)定管-ΔA空白管。（空白管只需做1-2次）

三、PEPC酶活計(jì)算

1、 按微量石英比色皿計(jì)算：

（1）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=321×ΔA÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T =321×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活定義：每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

PEPC酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×10⁹×V反總÷（V樣÷V樣總×N）÷T=321×ΔA÷N

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/ mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，2×10^-4L；V樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；V樣總：加入提取液體

積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間：5min；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=10⁹nmol；N：細(xì)胞數(shù)量，以萬計(jì)。

2、 按96孔UV板計(jì)算：

將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：

1、 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，ΔA大于0.6時(shí)，建議將粗酶液用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)ΔA小于0.01時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（10min或15min）來測(cè)定。

2、 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過0.02。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g天竺葵葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A1測(cè)定-A2測(cè)定=1.013-0.9753=0.0377，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.0377-0.0015=0.0362，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活：

PEPC酶活（U/g質(zhì)量）=321×ΔA÷W=321×0.0362÷0.1=116.202 U/g 質(zhì)量。

2、 取0.1g蘆薈葉片加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清之后按照測(cè)定步驟操作，測(cè)得計(jì)算ΔA測(cè)定=A1測(cè)定-A2測(cè)定=0.7049-0.6699=0.035，ΔA空白=A1空白-A2空白=0.8407-0.8392=0.0015，ΔA=ΔA測(cè)定-ΔA空白=0.035-0.0015=0.0335，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活：

PEPC酶活（U/g質(zhì)量）=321×ΔA÷W=321×0.0355÷0.1=107.535 U/g 質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)：

[1] Zhang Y H, Wang Z M, Huang Q, et al. Phosphoenolpyruvate carboxylase activity in ear organs is related to protein concentration in grains of winter wheat[J]. Journal of cereal science, 2008, 47(2): 386-391.

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