L-乳酸（L-LA）含量檢測試劑盒說明書
微量法
注意：本產品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號：BC2235
規(guī)格：100T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL的比例配制試劑二溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

2. 試劑四：臨用前每瓶加入3 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃保存4周；

3. 標準品：臨用前加入1.04 mL蒸餾水配成100 μmol/mL 的標準溶液；2-8℃保存4周。

產品說明：
乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質代謝及細胞內能量代謝密切相關，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙 酮酸，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，H⁺傳遞給PMS生成的PMSH₂還原MTT生成紫色物質，在570nm處有特征吸收峰。

技術指標：
低檢出限：0.0771 μmol/mL
線性范圍：0.078-5 μmol/mL
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：
天平、研缽/勻漿器、離心機、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。 

操作步驟：具體操作步驟詳見“產品資料"附件

• 樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1. 組織：按照質量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細胞：按照細胞數量（10⁶個）：提取液一體積（mL）為5~10：1的比例（建議5×10⁶個細胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產生，12000g離心10min后取上清待測。

注意事項：

1. 
   

1. 
   

2. 如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以增加樣本量或者稀釋樣本后再進行測定。

3. 提取液一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取樣本。

4. 
   

實驗實例：

1. 取0.1g兔心加入1mL提取液一進行勻漿研磨離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后稀釋5倍，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.591-0.069=0.522，根據標準曲線y=0.412x-0.0214，x=1.319，按樣本質量計算含量得： L-LA含量（μmol/g 質量）= 1.1875×x÷W×稀釋倍數=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32 μmol/g質量。

2. 取100μL小鼠血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.572-0.211=0.361，根據標準曲線y=0.412x-0.0214，x=0.928，按照液體體積計算含量得： L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122 μmol/mL。

相關發(fā)表文獻：

1. Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

2. Xiaojin Luo,Weihua Shi，Haoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031)

3. Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

參考文獻：
[1] Jin Bingjun, Li Taiyuan, Zhang Chunfeng. Determination of lactic acid concentration in bovine blood by enzymatic method [J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 1990, 16(07): 23-25.    [2] Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
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