WB實(shí)驗(yàn)的步驟較多，耗時(shí)均較長(zhǎng)，且每步都影響其結(jié)果表現(xiàn)。我們將常見(jiàn)問(wèn)題總結(jié)歸納，下面將對(duì)各問(wèn)題進(jìn)行分類(lèi)總結(jié)，并對(duì)出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因進(jìn)行分析，給出相應(yīng)的解決辦法。
無(wú)信號(hào)，沒(méi)有陽(yáng)性條帶
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果中常出現(xiàn)白板或者條帶無(wú)信號(hào)響應(yīng)現(xiàn)象，我們針對(duì)出現(xiàn)該現(xiàn)象可能的原因主要從抗體，抗原，實(shí)驗(yàn)操作和緩沖液幾方面進(jìn)行分析。
1、抗體相關(guān)原因：
WB中所用到抗體包括一抗和二抗，在該問(wèn)題上，兩個(gè)抗體方面可能存在的原因以及相對(duì)應(yīng)的解決方法。
解決辦法：二抗選用不恰當(dāng)，選擇與一抗相匹配的二抗類(lèi)型，二抗需和一抗宿主的物種相同。無(wú)足夠量抗體結(jié)合目標(biāo)蛋白，降低一抗稀釋度；使用效價(jià)高的一抗；延長(zhǎng)抗體孵育時(shí)間;膜充分浸潤(rùn)在液體中。
2、抗原相關(guān)原因
抗原即所需要檢測(cè)目的蛋白，其相關(guān)原因可能是未被一抗識(shí)別或者是抗原量不足引起。
解決辦法：一抗不識(shí)別待檢測(cè)的目的蛋白，參照數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比抗原序列和蛋白序列，選擇合適一抗，確保會(huì)發(fā)生特異性反應(yīng)，抗原量不足或降解，每條泳道上樣量不低于20~30ug，使用蛋白酶抑制劑并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照。
實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果也至關(guān)重要，且需要重復(fù)摸索。無(wú)條帶出現(xiàn)可能是目標(biāo)蛋白未從膠轉(zhuǎn)移至膜上或者洗膜過(guò)度。
WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可能出現(xiàn)有目標(biāo)蛋白條帶，但是目標(biāo)條帶在膜上顏色較淺。該現(xiàn)象原因與無(wú)目標(biāo)條帶較為相似，可能導(dǎo)致該現(xiàn)象的原因我們也從4個(gè)方面進(jìn)行分析，并給出相應(yīng)的解決方法。
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