本試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定樣品中人P16蛋白的水平。向預先包被了人P16蛋白單克隆抗體的酶標孔中加入P16蛋白，溫育；洗滌后，加入HRP標記過的P16蛋白抗體。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶，然后加入底物A、B，產(chǎn)生藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中人P16蛋白的濃度呈正相關(guān)。

試劑盒組成

1	標準品（16μg/ml）	0.5ml	7	顯色劑A液	6ml
2	標準品稀釋液	3ml	8	顯色劑B液	6ml
3	酶標包被板	12孔×8條	9	終止液	6ml
4	酶標試劑	6ml	10	說明書	1份
5	30倍濃縮洗滌液	20ml	11	封板膜	2張
6	樣品稀釋液	6ml	12	密封袋	1個

需要而未提供的試劑和器材

1． 37℃恒溫箱。

2．標準規(guī)格酶標儀。

3．精密移液器及一次性吸頭

4．蒸餾水，

5．一次性試管

6．吸水紙

注意事項

1．從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差

3．建議所有標準品、樣本都做雙份檢測。如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再按說明書操作進行測定，計算時請后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

4．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

5．為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

6．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

7．底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；將稀釋后的洗滌液少0.35ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復此過程數(shù)次。

自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中

標本要求

1．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

2．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融

操作程序

1．標準品的稀釋：（本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶請按照說明自行在小試管中倍比稀釋）：

8μg/ml	（5號標準品）	120μl的原倍標準品加入120μl的標準品稀釋液
4μg/ml	（4號標準品）	120μl的5號標準品加入120μl的標準品稀釋液
2μg/ml	（3號標準品）	120μl的4號標準品加入120μl的標準品稀釋液
1μg/ml	（2號標準品）	120μl的3號標準品加入120μl的標準品稀釋液
0.5μg/ml	（1號標準品）	120μl的2號標準品加入120μl的標準品稀釋液

2．分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品孔中加入稀釋好的標準品50μl；在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品終稀釋度為5倍）。輕輕晃動混勻，37℃溫育30分鐘。

3．棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。

4．每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。輕輕晃動混勻，37℃溫育30分鐘。

5．棄去液體，甩干，每孔加滿稀釋后洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。如此重復5次，拍干。

6．每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10分鐘.

7．取出酶標板，每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。

8．測定：以空白孔調(diào)零，在450nm波長下測量各孔的吸光度值（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內(nèi)進行。

9．根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。應記住由于樣品稀釋了的，其實際濃度應該乘以總稀釋倍數(shù)。

操作程序總結(jié)：

準備試劑，樣品和標準品

加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30分鐘

洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30分鐘

洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10分鐘

加入終止液

15分鐘之內(nèi)讀OD值

計算

檢測范圍：0.2μg/ml→10μg/ml。

規(guī)格： 96T/盒

保存： 2-8℃

有效期： 6個月（2-8℃）。

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人P16蛋白酶檢測說明書